本站讯（生命科学学院供稿）KRAS是肿瘤中最常见的突变基因，在胰腺癌、结直肠癌和肺癌中最为常见。KRAS蛋白是一种小GTP酶，在非活性的GDP结合形式和活性的GTP结合形式之间转换，以此来调节细胞的存活、生长和分化等信号。当KRAS发生突变后会抑制其固有GTP酶活性，导致下游信号组成性激活从而引发细胞癌变。KRAS突变主要集中在G12位点上，最常见的三种突变是G12D、G12V和G12C。理论上KRAS G12突变体是临床上肿瘤治疗理想的药物靶点，但由于KRAS蛋白表面较为平坦，缺乏小分子特异性结合的口袋，严重阻碍了小分子抑制剂的开发。共价抑制剂的出现给靶向KRAS突变蛋白药物的开发带来了希望。FDA分别在2021年和2022年批准了Sotolasib和Adagrasib用于治疗晚期KRAS-G12C突变的非小细胞肺癌。基于盐桥设计的靶向KRAS-G12D突变的小分子MRTX-1133也进入了临床试验。目前为止，靶向KRAS-G12V突变的小分子抑制剂还没有报道。2022年有报道称将靶向KRAS-G12D突变抗原的HLA-C*08:02限制性的TCR-T细胞输注到一名胰腺癌患者体内，6个月后转移灶消退了72%。这一结果证明靶向肿瘤内在KRAS突变抗原的TCR-T细胞疗法可能是治疗实体瘤的一种有前途的策略。因此开展KRAS新抗原特异性TCR的筛选和识别机制的研究对于肿瘤的免疫治疗具有重要意义。
2024年4月29日，天津大学叶升课题组、上海交通大学王锋课题组、中国科学院微生物研究所周旭宇课题组合作，在Communications Biology杂志在线发表题Identification and affinity enhancement of T-cell receptor targeting a KRASG12Vcancer neoantigen的研究论文，通过抗原肽在线预测、转基因小鼠的多肽免疫、单细胞测序技术和X射线晶体学等研究手段，鉴定了靶向KRASG12V突变抗原的特异性T细胞受体（TCR）并阐明了其识别机制，利用基于结构的理性设计筛选到亲和力提高的TCR突变体，其对携带相同KRAS突变的癌症具有治疗潜力。
首先，研究人员通过KRAS突变蛋白抗原肽的在线预测和对HLA-A*11:01转基因小鼠的多肽免疫，筛选到能够引起小鼠免疫反应的KRASG12V突变抗原肽VVGAVGVGK（图1）。并通过单细胞测序技术鉴定出靶向KRASG12V突变抗原的特异性TCR序列。
图1流式检测三种预测抗原肽刺激小鼠PBMC表达IFN-γ的细胞比例（a）和KRASG12V抗原肽刺激小鼠PBMC中tetramer+CD8+T细胞的比例（b）。
随后，研究人员在体外复性了靶向KRASG12V突变抗原肽的4TCR2蛋白，并解析了其与HLA-A*11:01-KRAS8-16G12V复合物的结构（图2）。该结构与传统的αβTCR与pMHC结合方式类似，TCR对KRASG12V突变多肽的特异性识别主要由TCR CDR3β介导。CDR3β loop中的D94、R95和S98分别与KRASG12V九肽的G8、A4和G6形成氢键（图2）。CDR3β与KRASG12V的结合主要位于九肽的中后段，包含了V5突变位点。随后通过对4TCR2与KRASG12V之间的范德华力相互作用的分析，发现4TCR2 CDR3β loop主要与KRASG12V九肽中的第5、6、7位氨基酸之间存在范德华力相互作用，约占总相互作用的86%。此外，CDR3β loop中的R95和S98与KRAS8-16G12V九肽V5突变位点直接相互作用可能是4TCR2识别KRAS8-16G12V的关键因素。
图2 HLA-A*11:01-KRASG12V-4TCR2复合物结构
（a）HLA-A*11:01-KRASG12V-4TCR2复合物整体结构。（b）4TCR2在 HLA-A*11:01-KRASG12V复合物上的位置。（c）4TCR2 CDR3β与KRAS8-16G12V的相互作用。氢键用黑色虚线表示（左），范德华接触用黄色虚线表示（右）。
由于，T细胞发挥最强活性的亲和力阈值为5-10 µM，而4TCR2与HLA-A*11:01-KRASG12V之间亲和力相对较弱（KD=30.8 μM），因此研究人员通过基于结构的理性设计筛选到亲和力提高至2 µM的4TCR2 βK51M-E100H双突变体4TCR2-MH，并且未检测到4TCR2-MH与KRASWT多肽的结合，表明通过基于结构理性设计的TCR突变体在提高亲和力的同时保留了对KRASG12V抗原肽的特异性。研究人员进一步解析了HLA-A*11:01-KRASG12V-4TCR2-MH复合物的结构（图3），与4TCR2-WT的复合物相比，TCR与pMHC的对接角度保持不变，并且两种复合物在TCR CDR loop区域的的变动极小，这表明相对保守的设计策略并没有显著改变相互作用界面或邻近的侧链。通过对结构的分析（图3），4TCR2-MH亲和力提高的原因主要有两点：（1）在TCR突变体β链的第51位上，中性残基（甲硫氨酸，M）取代了带正电荷的残基（赖氨酸，K）使得该位点的静电势从正到中性的转变，这种转变使得TCR与HLA-A*11:01在表面形状上更加互补，从而增强了二者的结合；（2）βE100H与MHC残基A149和A150形成了疏水相互作用，这些突变导致pMHC的埋藏溶剂可及表面积增加了2%。
图3 4TCR2-WT/MH和HLA-A*11:01-KRASG12V的表面静电势
（a）4TCR2-WT β链K51残基的表面电荷。（b）在HLA-A*11:01- KRASG12V-4TCR2-WT复合物中pMHC蛋白的表面静电势。（c）pMHC上与4TCR2-WT-βK51邻近的残基。（d）pMHC上与4TCR2-WT-βE100邻近的残基。（e）4TCR2-MH β链M51残基的表面电荷。（f）pMHC在HLA-A*11:01-KRASG12V-4TCR2-MH复合物中的表面静电势。（g）pMHC上4TCR2-MH-βM51邻近的残基。（H）pMHC上4TCR2-MH-βH100邻近的残基。表面静电势：蓝色-正电位，红色-负电位。
综上，该研究揭示了4TCR2特异性识别KRASG12V的分子机制，并筛选得到一个亲和力增强的4TCR2-MH突变体，其对携带相同KRAS突变的癌症具有治疗潜力。
天津大学生命科学学院叶升教授，上海交通大学医学院王锋研究员和中国科学院微生物研究所周旭宇研究员为本文的共同通讯作者。天津大学生命科学学院博士研究生张梦宇、中国科学院微生物研究所博士研究生徐威和上海大学医学院副研究员罗凌杰为本文的共同第一作者。中国科学院杭州医学研究所关凤慧副研究员，中国科学院微生物研究所张建华助理研究员，天津大学生命科学学院博士研究生王向尧和朱培也参与了这项工作。天津大学生命科学学院为本文第一单位。该研究得到科技部、国家自然科学基金委员会、中央高校基础科研基金等的资助。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s42003-024-06209-2
（编辑 赵晖 常可盈）
