作为天津大学对口支援龙岩学院、两校生命科学学院深度合作的研究成果，2025年7月17日，天津大学医学部生命科学学院联合龙岩学院生命科学学院、季华实验室在合成生物学领域期刊《ACS Synthetic Biology》发表题为“Metabolic engineering of Yarrowia lipolytica with massive gene assembly and genomic integration”的研究论文。该研究在解脂耶氏酵母中实现大规模外源基因转录单元的组装及整合入基因组，可在单轮实验整合包含12个外源基因转录单元的DNA大片段（总长可达35 kb），为解脂耶氏酵母的代谢工程提供了一种高效的改造策略。
图1 脂耶氏酵母大规模基因组装与整合策略示意图
1.研究背景
合成生物学的发展加速了细胞代谢工程的改造能力，能够构建>10步甚至更长的产物合成途径。然而，底盘代谢的全局层面可能存在众多因素影响目标产物的合成。如何组合与协调内源基因与外源途径，能否有效增强代谢流向目标产物合成是一个系统性工程，需要进行大量基因组合的遗传改造测试。因此，对于细胞代谢的系统化改造，需要建立大规模基因组装与基因组整合策略，一次性为底盘细胞引入更多可变的代谢驱动力。
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一种具有产油能力的非模式酵母底盘，是生产柠檬酸、功能蛋白以及亲脂性产物（如脂肪酸、油脂、萜类等分子）的优良菌株。然而该酵母天然偏好DNA“非同源末端连接”（Non-Homologous End Joining, NHEJ）修复方式，导致外来DNA片段转入细胞中后，往往会因NHEJ而随机插入到基因组中。这非常不利于含有多基因的长代谢路径（尤其包括10个以上反应）精准组装。因此，如何在解脂耶氏酵母中实现多DNA片段的“同源重组”（Homologous Recombination， HR），是一个关键问题。以往的研究通过敲除Ku70以提升HR效率，但可能引发细胞生长与代谢活力的下降，以及不可预测的DNA损伤。为此，研究团队提出“跨物种预组装+二次组装整合”思路，依靠同源臂设计来增加HR效率，实现大规模基因（>10个）的精准组装与整合。
2.研究内容
研究团队提出的“跨物种预组装+二次组装整合”策略包含两个步骤：
（1）跨物种预组装：选取模式底盘酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中功能研究较多、注释清晰的核心代谢基因，构建成标准化设计的解脂耶氏酵母转录单位（Yl-TU）；进一步利用酿酒酵母高效的HR能力，实现多个Yl-TU的预组装，获得10 kb左右DNA片段。由于该步骤的高效性（80%~100%的组装效率），可用于预组装多样化Yl-TU组合，作为模块库。
（2）二次组装整合：由于解脂耶氏酵母底盘的GC含量显著高于酿酒酵母，因此采用“高AT比例（约70%）序列”的同源臂设计，以期降低NHEJ概率；通过将预组装的多个10 kb片段以及辅助基因组整合的片段（LCIS-筛选标签-Hx以及Hy-RCIS，Hx与Hy代表同源臂）转入解脂耶氏酵母中，依赖同源臂进行HR。该过程可实现一次性组装及向基因组整合含有12个基因的全长35 kb片段。利用这种策略，可大幅减少向解脂耶氏酵母中迭代转入外源基因的次数，减少筛选标签的使用个数，简化细胞改造流程。使用该策略已构建最多导入35个基因（含33个外源基因与2个内源基因的Yl-TU，累计长度93.5 kb）的底盘菌株。
为了探究大规模外源基因的导入对解脂耶氏酵母代谢的影响，研究团队测试了大规模基因组装策略对复杂代谢通路的工程化改造能力，以酵母生产番茄红素为例筛选高产菌株。首先，研究人员以质粒形式测试了70余个单基因Yl-TU对番茄红素合成的影响，进一步筛选选取20个基因用于多基因Yl-TU组装。之后，将这些Yl-TU在酿酒酵母中组装获得5种“4基因Yl-TU”的10 kb级片段。最后根据预设的同源臂重组关系，将这些多片段及辅助片段转入解脂耶氏酵母中。研究发现，并非有助于番茄红素合成的Yl-TU数目越多越好，而是要进行适配的组合，才能显著提升解脂耶氏酵母对番茄红素的产量。
通过筛选获得的性状最优菌株中整合了POT1, PDA1, ADH1, LOT6这4个酿酒酵母来源基因的组装体，其相比初始菌的番茄红素摇瓶发酵产量提升至272%，达到790.7 mg/L。经发酵条件优化，最终在5 L生物反应器中分批补料发酵获得2144.83 mg/L的番茄红素产量（144.58 mg/g DCW），较初始菌株产量提升了7.4倍。本研究不仅为解脂耶氏酵母遗传改造提供了一次性整合大量基因的便利工具，还提供了一种该酵母中代谢多路径同时调控的技术方法，有助于对底盘进行更大尺度的代谢优化改造以及大幅提高改造效率。
图2 大规模外源基因的整合对脂解耶氏酵母生产番茄红素的影响
3.联合团队协同互作
论文通讯作者是天津大学医学部生命科学学院王汉杰教授、龙岩学院生命科学学院尹会方副教授及季华实验室刘宏研究员，共同第一作者是天津大学医学部生命科学学院研究生崔钰惠、薛慧敏及刘夺副研究员。其中，天津大学医学部生命科学学院承担课题设计与菌株设计构建工作，龙岩学院生命科学学院承担菌株发酵条件测试工作，季华实验室承担菌株代谢检测分析工作。本工作是天津大学对口支援龙岩学院开展联合研究的成果，体现了两校生命科学学院的深度协作。所开发技术可助力于微生物菌种的构建，生产营养产物的菌株可作为营养饲料添加成分，对于畜牧业发展具有重要价值。两个院校在食品、农业领域的持续深度合作不仅为闽西革命老区科研发展注入新动能，更通过技术积累为区域相关产业升级提供核心支撑。研究获得国家重点研发计划项目以及天津市、福建省、广东省科研项目支持。
文章链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.5c00333?ref=pdf
